Проточная цитометрия

Проточная цитометрия — метод исследования дисперсных сред в режиме поштучного анализа элементов дисперсной фазы по сигналам светорассеяния и флуоресценции.
Название метода связано с основным приложением, а именно, с исследованием одиночных биологических клеток в потоке.

Основа метода заключается:
  1) использовании системы гидрофокуссировки, которая обеспечивает прохождение клеток в потоке поодиночке;
  2) облучении клетки лазерным излучением;
  3) регистрации сигналов светорассеяния и флуоресценции от каждой клетки.

Кроме того, в ходе анализа учитывается уровень флуоресценции химических соединений, входящих в состав клетки (аутофлуоресценция) или внесённых в образец перед проведением проточной цитометрии.

• 
  Схема оборудования для проведения проточной цитометрии.

Принцип

Клеточная суспензия, предварительно меченная флюоресцирующими моноклональными антителами или флуоресцентными красителями, попадает в поток жидкости, проходящий через проточную ячейку.
Условия подобраны таким образом, что клетки выстраиваются друг за другом за счет т. н. гидродинамического фокусирования струи в струе.
В момент пересечения клеткой лазерного луча детекторы фиксируют:
   - рассеяние света под малыми углами (от 1° до 10°) (данная характеристика используется для определения размеров клеток).
   - рассеяние света под углом 90° (позволяет судить о соотношении ядро/цитоплазма, а также о неоднородности и гранулярности клеток).
   - интенсивность флуоресценции по нескольким каналам флуоресцентности (от 2 до 18-20)- позволяет определить субпопуляционный состав клеточной суспензии и др.

Преимущества

Короткое время анализа за счет высокой скорости (до 100 000 событий в секунду)
Анализ большого количества клеток (до 108 клеток в мл)
Определение субпопуляций клеток
Измерение параметров редко встречающихся клеток
Объективное измерение интенсивности флуоресценции

Применение

В настоящее время проточная цитометрия применяется для выявления определённых клеток в исследуемых образцах (как бактериальных и грибковых, так и собственных клеток организма человека), определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам, а также мониторирования состояния вирусного процесса у ВИЧ-инфицированных пациентов.

Выявление бактериальных, грибковых, а также собственных клеток организма в биологических жидкостях крайне важно для диагностики многих заболеваний. В ходе одного из исследований было показано, что проточная цитометрия обладает в 100—1000 раз более высокой чувствительностью по сравнению с микроскопией и позволяет выявлять бактериальные клетки в количестве 10-100 в 1 мл крови. При более низкой концентрации бактерий в образце возможно проведение предварительной инкубации. Высокую чувствительность методу придает использование моноклональных антител, помеченных флуоресцирующим веществом.

Применение

Иммунология

• Иммунофенотипирование клеток периферической крови
  
• Определение фагоцитарной активности (захват меченных флюорохромами бактерий или дрожжей)
  
• Определение внутриклеточных цитокинов (спонтанная продукция и под действием различных специфических или неспецифических активаторов, таких как ФМА + иономицин, ЛПС, ФНО-альфа)
  
• Определение внутриклеточных белков, например транскрипционных факторов GATA-3, T-bet, FoxP3 для дискриминации CD4 Т-лимфоцитов
  
• Определение пролиферативной активности (выявление инкорпорированого бромдезоксиуридина)
  
• Исследование клеточного цикла
  
• Оценка клеточной цитотоксичности

Цитология

• Определение цитоморфологической принадлежности клетки размер, соотношение ядро/цитоплазма, степень асимметричности и гранулярности клеток
• Оценка активности внутриклеточных ферментов с помощью флуорогенных субстратов
• Определение экспрессии поверхностных антигенов
• Анализ стадий клеточного цикла
• Измерение физиологических параметров клетки (внутриклеточный pH, концентрация свободных ионов Ca2+, потенциал наружной клеточной мембраны)

Фармакология

• Измерение экспрессии маркеров
• Измерение активности внутриклеточных ферментов
• Определений стадий клеточного цикла в рамках изучения механизмов воздействия различных биологически активных веществ на клеточном уровне

Растениеводство / Сельское хозяйство

• Определение плоидности клеток
• Анализ клеточного цикла
• Анализ и сортировка протопластов

Проточная цитометрия позволяет не только выявлять инфицирование микроорганизмами, но и определять спектр их чувствительности, причём, длительность исследования не превышает нескольких часов. Подвергнутые воздействию антибиотиков (in vivo или in vitro) микроорганизмы сравнивают с контрольными образцами того же штамма для установления их жизнеспособности, а также изменений в нуклеиновых кислотах, белках, оболочке клеток и т. п., что позволяет оценить как степень эффекта антибиотика, так и точку приложения его действия.

Ещё одной областью применения проточной цитометрии является мониторирование состояния вирусного процесса у ВИЧ-инфицированных лиц путём определения абсолютного количества CD4+ клеток и их доли в популяции лимфоцитов (отношение CD4+/CD8+). Методика может также использоваться для контроля эффективности проводимой терапии.